CRISPR–Cas13d, Terobosan Baru dalam Bioteknologi Tanaman

CRISPR–Cas13d merupakan bagian dari sistem CRISPR kelas 2, dengan tipe lokus VI-D, yang menargetkan editing RNA, berbeda dengan Cas9 yang mentargetkan editing DNA. Sistem ini kini menjadi perhatian karena memberikan pendekatan baru dalam teknik genom editing pada tanaman, khususnya dalam manipulasi pascatranskripsi dengan tanpa mengubah genom tanaman secara permanen. Sistem ini pertama kali teridentifikasi dari bakteri anaerob seperti Ruminococcus dan Eubacterium. Keunggulan dari Cas13d karena ukuran enzimnya yang kecil (~930 asam amino) dan efisiensinya dalam memotong RNA target secara lebih spesifik.

Struktur dan Mekanisme Cas13d

Cas13d memiliki struktur bilobed dengan domain utama: Recognition (REC) dan Nuclease (NUC). Domain NUC memuat dua domain HEPN (Higher Eukaryotes and Prokaryotes Nucleotide-binding), yang berperan sebagai pusat katalitik pemotongan RNA. Cas13d bekerja dengan crRNA yang memandu ke RNA target, membentuk kompleks ternary (Cas13d-crRNA-ssRNA) untuk pemotongan yang spesifik. Keunikan Cas13d adalah kemampuannya memproses pre-crRNA tanpa memerlukan protospacer flanking sequence (PFS), sehingga fleksibel menarget RNA jenis apa pun.

Aplikasi CRISPR–Cas13d dalam Bioteknologi Tanaman

1. Resistensi terhadap Virus Tanaman

Cas13d telah digunakan untuk mengembangkan tanaman yang tahan terhadap berbagai virus RNA seperti potato virus Y (PVY), tobacco mosaic virus (TMV), dan rice stripe mosaic virus (RSMV). Studi menunjukkan Cas13d (CasRx) lebih efektif daripada Cas13a/b dalam menghambat replikasi virus di tanaman model seperti Nicotiana benthamiana. Cas13d mampu menarget virus tanpa aktivitas kolateral yang tidak diinginkan.

2. Pengendalian Hama

Cas13d juga diuji untuk mengganggu ekspresi gen esensial pada hama, contohnya pada planthopper mata putih (Sogatella furcifera). Sistem Cas13d-SPc (nanopartikel) berhasil menurunkan ekspresi gen SfTO, menyebabkan perubahan fenotip mata Sogatella furcifera menjadi merah sebagai indikator keberhasilan knockdown gen target.

3. Diagnostik Virus Secara Cepat

Cas13d dikombinasikan dengan teknologi tRNA-processing system (PTG) dapat digunakan untuk mendeteksi RNA virus tanpa amplifikasi, memungkinkan deteksi virus di tanaman dalam waktu <30 menit, berpotensi mendukung pengendalian penyakit di lapangan.

4. Regulasi Multi-gen

Cas13d memungkinkan knockdown simultan beberapa target RNA (misalnya miRNA, lncRNA, circRNA) dengan satu crRNA array, membuka peluang riset regulasi gen dan jalur metabolisme dalam tanaman.

Kelebihan dan Tantangan

Kelebihan:

1. Ukuran kecil, mudah diintegrasikan ke dalam vektor ekspresi.
2. Tidak memerlukan PFS → target RNA lebih fleksibel.
3. Aktivitas tinggi, risiko off-target minimal dalam tanaman.
4. Dapat diprogram untuk multi-target RNA editing.

Tantangan:

1. Masih terbatasnya data preferensi guide RNA pada tanaman.
2. Desain guide RNA untuk aplikasi high-throughput perlu dioptimalkan.
3. Efektivitas Cas13d dalam berbagai spesies tanaman memerlukan validasi lebih lanjut.

Prospek Masa Depan

Dengan kemajuan riset, Cas13d diharapkan menjadi alat utama untuk: Perbaikan ketahanan tanaman terhadap patogen.Studi fungsi gen dalam skala transkriptom. Pengembangan varietas tanaman baru melalui regulasi ekspresi RNA spesifik. Diagnostik cepat untuk pemantauan kesehatan tanaman.

Upaya lebih lanjut dalam optimasi desain guide RNA dan integrasi dengan teknologi delivery (seperti nanomaterial) akan memperluas aplikasi Cas13d dalam bioteknologi tanaman modern.

Referensi:

Sarkar, J., Jyoti, T.P., Sahana, S. et al. CRISPR–Cas13d in plant biology: an insight. Plant Biotechnol Rep 18, 301–311 (2024). https://doi.org/10.1007/s11816-024-00893-6

Artikel Selengkapnya...

Revolusi Genom Editing dalam Bioteknologi Tanaman

Kebutuhan pangan global diprediksi akan meningkat dua kali lipat pada tahun 2050, sementara lahan subur terus menyusut akibat perubahan iklim, degradasi lingkungan serta adanya alih fungsi lahan subur. Dalam kondisi ini, teknologi pemuliaan tanaman konvensional tidak lagi mencukupi. Sebagai respons, bioteknologi tanaman telah mengalami revolusi besar melalui perkembangan teknologi genome editing, atau biasa dikenal dengan CRISPR/Cas9, yang memungkinkan dilakukannya modifikasi genetik yang sangat presisi dan efisien.

Detection of Somaclonal Variation in Jatropha curcas Linn. Plantlets Regenerated from Somatic Embryo using ISSR Markers

Dari Transgenik ke Editing Genom

Perkembangan awal dari bioteknologi tanaman dimulai dengan teknologi transgenik yakni dengan memasukkan gen asing ke dalam genom tanaman untuk memperoleh sifat baru. Meski berhasil meningkatkan produktivitas dan ketahanan terhadap cekaman biotik dan abiotik, produk tanaman transgenik menghadapi tantangan sosial dan lingkungan, terutama terkait dengan integrasi gen asing ke dalam genom tanaman dan penggunaan marka resistensi antibiotik. Peralihan teknologi transformasi genetik ke genom editing, terutama dengan CRISPR/Cas9, memungkinkan dilakukannya manipulasi gen tanaman tanpa harus memasukkan DNA asing, Hal ini menjadikan tanaman hasil genom editing lebih dapat diterima masyarakat.

Perkembangan Sistem CRISPR/Cas9

Teknologi CRISPR/Cas9 berasal dari sistem pertahanan bakteri terhadap virus. Keberadaan teknologi ini sejak ditemukan tahun 2012, telah berhasil merevolusi penelitian di bidang genetika tanaman. Teknologi ini menggunakan enzim Cas9 dan guide RNA (gRNA) mampu memotong sekuen DNA genom pada lokasi yang spesifik, lalu diperbaiki oleh mekanisme sel. Keunggulan utama CRISPR/Cas9 meliputi presisi, efisiensi, reproducible, dan kemampuan untuk melakukan multiplex editing (menyunting banyak gen sekaligus). Inovasi terkini seperti base editing dan prime editing telah meningkatkan presisi genom editing tanpa perlu memotong untai DNA genom tanaman.

Aplikasi dalam Menghasilkan Tanaman Unggul

Teknologi genom editing telah diaplikasikan pada beberapa komoditas tanaman pangan seperti padi, gandum, jagung, tomat, kentang, dll untuk meningkatkan ketahanan tanaman terhadap kekeringan, salinitas, hama, serta memperbaiki kualitas dan hasil produksi. Misalnya, gen ARGOS8 pada jagung disunting untuk meningkatkan toleransi terhadap kekeringan dan hasil panen; gen OsERF922 pada padi diubah untuk menambah ketahanan terhadap penyakit blast. Sistem CRISPR juga telah diterapkan untuk memperpanjang masa simpan buah melon dan mengurangi pencoklatan pada pasca panen buah terung.

Tantangan dan Prospek Masa Depan

Meskipun telah menunjukkan banyak kemajuan, teknologi genom editing menghadapi beberapa tantangan, seperti rendahnya efisiensi transformasi pada tanaman yang sulit direkayasa, efek off-target, dan keterbatasan pada urutan PAM. Namun, pengembangan pada Cas varian baru yang toleran terhadap suhu, sistem integrasi berbasis transposon, serta pendekatan seperti OMEGA dan CAST telah sedikit demi sedikit mengurai permasalahan tersebut.

Growth and Proline Accumulation in Response to Osmotic Stress Induced by Polyethylene Glycol Treatment in Tacca leontopetaloides Cultured In Vitro

Dalam kurun waktu satu dekade ini, teknologi genome editing berbasis CRISPR/Cas9 telah merevolusi bioteknologi tanaman. Dengan presisi tinggi, kemampuan multiplexing, dan tanpa adanya penggunaan gen asing, teknologi ini menjanjikan solusi mutakhir untuk mengembangkan tanaman masa depan yang toleran terhadap perubahan iklim dan mampu menunjang ketahanan pangan global. Pengembangan penelitian lebih lanjut dan kolaborasi para periset dalam skala global akan menjadi kunci keberhasilan dalam penerapan teknologi ini dalam skala luas pada kegiatan pemuliaan tanaman.

Referensi:

Ben-Amar, A. Potential of advanced genome editing tools in plant biotechnology and crop improvement: progress and challenges. Plant Cell Tiss Organ Cult 158, 16 (2024). https://doi.org/10.1007/s11240-024-02807-4

Artikel Selengkapnya...